花椒是高效指芸香科青椒和红花椒等去除种子和杂质的干燥成熟果皮，主要是液相作为中药和食物调味品。花椒在全世界250多种，色谱主要分布于亚洲、定量的建非洲、检测美洲及大洋洲的花椒含量热带及亚热带地区，亚洲是麻味花椒主产区，中国约有45种，物质13个变种。高效花椒在我国栽培历史悠久，液相在我国的色谱应用已有两千余年的历史，它有一定的定量的建药效成分，有杀虫、检测止痒、花椒含量抑菌、麻味抑制血小板凝集、抗氧化等作用。花椒中的主要化学成分有酰胺、生物碱、木脂素、挥发油等。
酰胺类物质是花椒的主要麻味成分，也是花椒主要的风味物质。目前，从花椒中分离得到的麻味物质总共25种，为一类链状不饱和脂肪酰胺物质，其中山椒素是代表性的麻昧物质，具有强烈的刺激性，结晶后为白色晶体。其化学性质极不稳定，在室温下放置几分钟后立刻变成黄色胶状，易溶于甲醇和丙酮，热乙醇，难溶于氯仿，不溶于石油醚，因此花椒酰胺类物质需在低温低氧的条件下密封保存。由于花椒麻味物质不易保存，用HPLC法对花椒中麻味物质的检测多在麻味物质分离纯化过程中，并采用与麻味物质的结构鉴定等相结合方式，具有操作繁琐等缺陷。目前，国内外尚未建立有关花椒麻味物质评价的标准方法，2015年版《中华人民共和国药典》对于花椒的质量控制并没有全面反映花椒活性成分，也未有可用于麻味检测的参比样品。因此，应用HPLC法检测花椒麻味物质含量就必须要制备标准品，这就加大了检测其含量的难度，从而限制了花椒的质量控制及标准体系等方面的应用。本文以实验室自制的花椒麻味物质为标准样品，建立了HPLC定量检测花椒麻味物质含量方法。期望为食品工业中花椒原料的筛选提供一定的理论依据，也为花椒产品的进一步开发和研究奠定基础。
一、材料和方法
1、实验材料
整粒花椒样品干燥粉碎，过60目筛(孔径＜O.03mm)，备用，采自全国的花椒生产基地，如四川、陕西、云南等地；甲醇：分析纯，成都科龙试剂厂；甲醇：色谱纯，天津四友试剂公司。
2、主要设备
分析型高效液相色谱仪：LC-10AT型，配有紫外可见光检测器，日本岛津公司；色谱柱：HC-C18型，安捷伦公司；电子天平：FA2004型，感量O.0001，上海精密电子仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9030型，上海-恒科学仪器有限公司。
3、方法
（1）花椒麻味物质的提取
将花椒麻味物质的提取可采用有机溶剂浸提法。操作方法是：称取一定量粉碎混匀后的花椒粉末，加入20倍的分析纯甲醇于40℃～50℃水浴振荡浸提后，离心过滤，取其上清液定容得待测样品液。
（2）色谱条件
检测条件：岛津LC-10AT型分析型高效液相色谱仪，HC-C18型色谱柱，以1.0mL／min15min50％甲醇和水溶液梯度洗脱，10min70％甲醇和水溶液洗脱，柱温为35℃，紫外检测波长254nm。
（3）检测方法
高效液相色谱(HPLC)的检测方法：外标法。以实验室自制的花椒麻味物质标准品为标准样品，经甲醇溶液溶解并定容后配成一系列不同梯度的标样溶液。分别吸取一定量的标样注入色谱柱中，测出色谱图中各目的物的峰面积，然后以HPLC的峰面积作为纵坐标，以对应的花椒麻味物质含量作为横坐标作图，作标准曲线。然后吸取同等量经预处理的待测样品液，与相同条件下检测，从色谱图上测出花椒麻味物质的峰面积，在标准曲线上查出所对应的待测样品中花椒麻味物质的含量。
（4）标准曲线的绘制
准确量取标准品(55μg／mL)，采用甲醇配制成一系列质量浓度的花椒麻味物质标准溶液(μg／mL)：O、10、20、30、40、45。然后分别抽取20μg溶液进行HPLC检测。以保留时间为22～24min的峰为目的峰，以其HPLC峰面积为纵坐标，对应标品浓度为横坐标，作标准曲线。
（5）方法学验证
分别对实验进行准确度、精密度、重复性和加标回收率的分析测定。
二、结果
1、最佳色谱分析条件的确定
经过大量的预备实验，分析研究了柱温对分离效果的影响。在柱温为室温25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、45℃等温度进行实验，发现柱温为35℃时，理论塔板数最高，洗脱峰时间间隔最大。研究中还发现，花椒麻味物质含量在0～300μg／mL范围内，花椒麻味物质的含量和响应峰的面积具有较高的线性相关度。
（1）洗脱剂最佳流速的确定
为了探求最佳的分离条件，在紫外检测波长254nm，柱温35℃，用15min的50％～70％甲醇和水溶液梯度洗脱以及10min70％甲醇和水溶液洗脱，流速在0.8～1.2mL/min进行检测，分离效果和峰形都一致(图l，2，3)。在1.2mL／min时出峰时间最快，效率最高，但考虑到1.2mL／min时色谱柱柱压过高，会严重影响色谱柱的使用年限，综合考虑流速1.OmL/min为最佳效果。
（2）洗脱剂最佳梯度的确定
当紫外检测波长为254nm，柱温为35℃，流速为1.0mL／min时，采用10min的50％甲醇和水溶液梯度洗脱，15min70％甲醇和水溶液洗脱；70％甲醇等度洗脱，采用15min的50％甲醇和水溶液梯度洗脱，10min70％甲醇和水溶液洗脱；以及其他梯度洗脱进行实验，结果表明检测条件为15min的50％甲醇和水溶液梯度洗脱，10min70％甲醇和水溶液时，洗脱的分离效果和峰形最佳。
因此，本实验中所确定的HPLC检测条件为：岛津LC-10AT型分析型高效液相色谱仪，色谱柱为HC-C18柱(4.6mm×250mm)，15min的50％甲醇和水溶液梯度进行洗脱，10min70％甲醇和水溶液洗脱，流速为1.0mL/min，柱温35℃，紫外检测波长为254nm。
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